使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 中是否存在污染 RNA？

通過在裂解步驟后立即執行優化的 RNase 消化步驟來消除 RNA 污染。

我預計可以從 FFPE 樣本中獲得多少 DNA？

影響獲得的 DNA 總量的最大變量是樣本本身的質量（即組織的類型和數量，以及樣本分離和保存的注意事項）。使用 DNAstorm™ 試劑盒，并假設樣品質量至少合理，可以獲得大于 1 µg 的量。

使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 可以用于下一代測序嗎？

是的。只要 DNA 的質量足夠高，就可以獲得高質量的文庫。

組織應該如何準備？

使用切片機從 FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片，因為它們可能無法全消化。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機械研磨相當于推薦切片數量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由于核心不使用切片機進行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機械均質化（例如使用鋼珠）。

您推薦哪種脫蠟方法？

DNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無毒，并且不需要使用通風柜。在我們的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。

將脫蠟試劑與 CAT5 裂解緩沖液混合后，我看到脫蠟試劑層和水層之間有白色混濁層。這是什么以及它如何影響提取？

白色混濁層是脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩沖液之間的乳液，當這兩種試劑渦旋或硬混時可能會形成。為避免此問題，我們建議在脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩沖液接觸時不要渦旋樣品。當需要在這兩種試劑存在的情況下混合時（例如添加蛋白酶時），我們建議使用移液器混合。通過以最大速度 (> 16,000 xg) 強力旋轉樣品至少 2 分鐘，可以去除白色渾濁層。時間長短取決于乳液的體積。

如何評估我獲得的 DNA 的完整性？

由于從 FFPE 組織樣品中分離出的 DNA 尺寸分布廣泛，我們建議使用脈沖場凝膠電泳 (PFGE)。也可以使用基于毛細管電泳的方法，例如安捷倫生物分析儀，但可能無法正確解析質量較好的樣品中的高分子量片段（大于 10k）。

為什么我提取的 DNA 無法正常擴增？我注意到很多 PCR 抑制和/或 Ct 值毫無意義。

當使用大量 FFPE 提取的模板 DNA 時，經常會觀察到 PCR 抑制。這種抑制通常不是由于污染物的存在，而是由于 DNA 本身的殘留化學修飾和損傷造成的。對 PCR 方案進行一些簡單的調整就可以解決這個問題。首先，應減少模板DNA的量。其次，PCR 聚合酶的量應增加 2-4 倍。第三，應延長退火和延伸時間。第四，可以增加dNTP的量。