使用貴金屬納米顆粒綴合物進(jìn)行免疫印跡

由于制備貴金屬納米顆粒（例如金和銀）的抗體綴合物相對(duì)容易，并且無(wú)需事先開發(fā)程序即可通過(guò)肉眼直接檢測(cè)，因此這些探針在許多測(cè)定中具有很大的用途。應(yīng)用包括快速測(cè)試，例如橫向流動(dòng)、垂直流動(dòng)、蛋白質(zhì)印跡和斑點(diǎn)印跡測(cè)定。此外，每種貴金屬納米粒子類型的光學(xué)特性 允許生成具有不同顏色的二次探針，可用于比色多重檢測(cè)，圖 1。

當(dāng)用貴金屬蛋白綴合物（例如二級(jí)金綴合物）探測(cè)印跡蛋白的膜時(shí)，在納米顆粒探針結(jié)合后，目標(biāo)蛋白的存在會(huì)以紅色指示，如圖 1 所示。免疫印跡和斑點(diǎn)印跡應(yīng)用中的銀到結(jié)合的金綴合物的靈敏度可與比色檢測(cè)方法相媲美。此外，二級(jí)貴金屬納米顆粒蛋白綴合物很好地適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡方案，并且對(duì)您當(dāng)前的檢測(cè)方案幾乎不需要改變。 

與傳統(tǒng)檢測(cè)探針相比，使用貴金屬納米顆粒蛋白綴合物進(jìn)行免疫印跡具有多種優(yōu)勢(shì)，例如： 

• 檢測(cè)無(wú)需開發(fā)

• 檢測(cè)不需要昂貴的成像設(shè)備

• 允許比色多重分析

以下是使用二級(jí)金綴合物檢測(cè)膜上抗原的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)印跡方案。相同的方案可用于金納米海膽、銀納米顆粒和合金納米顆粒蛋白質(zhì)綴合物探針。

標(biāo)準(zhǔn)免疫金斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)方案

1. 將 1 微升連續(xù)稀釋的蛋白質(zhì)（0.1 - 100 ng）滴在添加有 50 ug/ml BSA 的 PBS 中，滴在硝酸纖維素膜或 PVDF 膜上。

2. 讓蛋白質(zhì)滴干燥進(jìn)入膜中。

3. 在室溫下使用 1% (w/v) 奶粉的 1X PBS 將膜封閉 30 分鐘。

4. 與一抗在室溫下孵育 2 小時(shí)。

5. 用上述制備的封閉液清洗膜 3x5 分鐘。

6. 用 0.2% 奶粉按 1:10 (OD=0.3) 稀釋的二級(jí)金結(jié)合物孵育 2 小時(shí)（或更長(zhǎng)的時(shí)間以提高靈敏度）。注意：有關(guān)金綴合物的制備，請(qǐng)參閱技術(shù)說(shuō)明#102。

7. 如上所述洗滌 3x5 分鐘。

8. 干燥膜并記錄數(shù)據(jù)。

9. （可選）繼續(xù)進(jìn)行銀增強(qiáng)以提高靈敏度。

圖 1. 使用 Cytodiagnostics 膜銀增強(qiáng)試劑盒增強(qiáng)前后 Cytodiagnostics 鏈霉親和素金綴合物（左上）和我們的鏈霉親和素銀綴合物（右上）的斑點(diǎn)印跡分析示例。下圖展示了使用具有不同光學(xué)特性的貴金屬納米粒子綴合物的混合物同時(shí)多重檢測(cè)三種不同抗原，即抗人IgG 30nm金/銀(20/80)合金綴合物（綠色）、a-小鼠IgG 30nm金/銀 (80/20) 合金綴合物（紅色）和 a-兔 IgG 40nm 金綴合物（紫色）。

圖 2. 垂直流斑點(diǎn)印跡免疫分析中的多重檢測(cè)。左圖顯示 3 個(gè)抗原（紅點(diǎn)）和對(duì)照中的 2 個(gè)呈陽(yáng)性檢測(cè)。右圖顯示使用兩種不同顏色的納米顆粒探針（紅色：金納米顆粒，藍(lán)色：金納米海膽）對(duì)兩種不同抗原的陽(yáng)性檢測(cè)。 

圖 3. 使用兔抗肌動(dòng)蛋白一抗對(duì)純化肌動(dòng)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，然后使用 10nm 抗兔 IgG 金綴合物進(jìn)行二次檢測(cè)，并使用 Cytodiagnostics 膜銀增強(qiáng)試劑盒進(jìn)行增強(qiáng)。