乙酰輔酶A測試盒

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

乙酰輔酶A廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。是生物體能源物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的一種重要的中間代謝產(chǎn)物。在體內(nèi)能源物質(zhì)代謝中是一個樞紐性的物質(zhì)。糖、脂肪、蛋白質(zhì)三大營養(yǎng)物質(zhì)通過乙酰輔酶A匯聚成一條共同的代謝通路-三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，經(jīng)過這條通路氧化生成二氧化碳和水，釋放能量用于ATP合成。此外，乙酰輔酶A是合成脂肪酸，酮體，膽固醇及其衍生物等生理活性物質(zhì)的前體物質(zhì)。

測定原理

蘋果酸脫氫酶可催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。檸檬酸合酶可催化乙酰輔酶A和草酰乙酸生成檸檬酸和輔酶A。利用蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合酶的偶聯(lián)反應(yīng)，乙酰輔酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反應(yīng)了乙酰輔酶A含量的高低。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存。臨用前加入250μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：液體10uL×1支，4℃保存。臨用前加入250μL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入22.5mL試劑五充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：液體30mL×1瓶，4℃保存。

工作液的配制：臨用前請根據(jù)擬用工作液體積（樣本數(shù)×0.23 m L），將試劑二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把試劑二和試劑三加入到試劑四中混勻（可以測定96樣）；加樣前置37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱30 min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

乙酰輔酶A的提取

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，用蒸餾水于340nm處調(diào)零。

2. 將工作液置37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴鍋中預(yù)熱10 min。

2、取25μL樣本和230μL工作液至微量石英比色皿或者96孔板，混勻，立即記錄340nm處20s的吸光值A(chǔ)1和80s時的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。

乙酰輔酶A含量計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 1640x + 0.012；x為吸光值，y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。

注意：本試劑盒*低檢測限為1.6nmol/mL。

（1）按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

乙酰輔酶A含量(nmol/g 鮮重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

乙酰輔酶A含量(nmol/104)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 3280x + 0.024；x為吸光值，y為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）。

注意：本試劑盒*低檢測限為1.6nmol/mL。

（1）按照蛋白濃度計算

乙酰輔酶A含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA＋0.024) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計算

乙酰輔酶A含量（nmol/g 鮮重）=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024) ÷W

 (3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

乙酰輔酶A含量（nmol/104）=[(3280×ΔA＋0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)÷500

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；V2：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

上海牧榮生物科技有限公司

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