RNApure（TRIzol）是廣譜型總RNA提取試劑。實(shí)驗(yàn)操作快速方便，顏色鮮明，便于分層。本試劑適用范圍廣泛，可以從動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細(xì)胞等 樣品中提取總RNA。樣品在RNApure中被充分裂解的同時(shí)能夠***限度地保證RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液會(huì)分成三層：上層無色水相、中間層和下層紅色有機(jī)相， RNA分布在上清層中。收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。提取的總 RNA完整性好，無蛋白和DNA污染，可用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如RT-PCR、 Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等。

自備試劑

氯仿(新開封或提取 RNA 專用)、無水乙醇。 

操作步驟

1．各種材料的處理

1）植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在 RNApure中迅速研磨，每 30-50 mg 組織加入 1ml RNApure，渦旋混勻。

注意：樣品體積一般不要超過 RNApure 體積的 10%。

2）動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存的動(dòng)物組織盡量剪碎，每 30-50mg 組織加入 1mlRNApure，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。或在液氮中研磨后加入 1ml RNApure 混勻。

注意：樣品體積一般不要超過 RNApure 體積的 10%。

3）單層培養(yǎng)細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，可直接在培養(yǎng)板中加入適量 RNApure（每 10cm2面積需要 1ml RNApure），用取樣器反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至 Rnase-free 的離心管中，13000×g 離心 5 分鐘，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清，加入 1ml RNApure 混勻。

注意：a. 收集細(xì)胞數(shù)量不要超過 1×10?。

b. RNApure 加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果 RNApure 加量不足，可能導(dǎo)致提取的 RNA 中有 DNA 污染。

c. 收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致裂解不全，造成 RNA 的產(chǎn)量降低。

4）細(xì)胞懸液：離心收集細(xì)胞。每 5×10?-1×10?動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每 10?細(xì)菌細(xì)胞加入 1 ml RNApure。

注意：

a. 加入 RNApure 前不要洗滌細(xì)胞，以免 RNA 降解。

b. 一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀或液氮研磨處理。

5）血液處理：直接取新鮮的血液，加入 3 倍體積 RNApure（推薦 0.25ml 全血加入 0.75mlRNApure），充分振蕩混勻。

6）可選步驟：對(duì)于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組織或植物的塊莖，可以在勻漿處理后 4℃，13,000×g 離心 10 分鐘以除去不溶物質(zhì)，此時(shí)沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的 DNA，而 RNA 存在于上清中。

2．樣品中加入 RNApure 后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置 5 分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物*全分離。

3．以每 1ml RNApure 加入 200ul 氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩 15 秒，室溫放置 2 分鐘。

4．4℃ 13,000×g 離心 10 分鐘，此時(shí)樣品分為三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無色水相，RNA 主要在上層水相中，將上層水相移到一個(gè)新的 Rnase-free 離心管（自備）中。

5．在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置 10 分鐘。

6．4℃ 12,000×g 離心10分鐘，棄上清。

7．加入75%乙醇（用Rnase-free Water配制）洗滌沉淀。每使用1ml RNApure用1ml75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。

8．4℃ 12,000×g 離心3分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉淀。

注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。

9．室溫放置 2-3 分鐘，晾干。加入 30-100ul Rnase-free Water，充分溶解 RNA，得到的RNA 保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過分干燥，以免難于溶解。

本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途

上海牧榮生物科技有限公司

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總RNA提取試劑